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技術(shù)支持

酶標(biāo)儀在測定真菌毒素檢測技術(shù)的探究
更新時(shí)間:2016-04-18   點(diǎn)擊次數(shù):3838次
酶標(biāo)儀測定的原理是在特定波長下,檢測被測物的吸光值。光通過被檢測物,前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量,特定波長下,同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系。檢測單位用 OD 值表示,OD 是 optical delnsity(光密度)的縮寫,OD=1og(1/trans),其中 trans 為檢測物的透光值。根據(jù)蘭伯—比爾定律,OD值與光強(qiáng)度成下述關(guān)系:E=OD=logΙ0/Ι,其中:E 表示被吸收的光密度;Ι0 為在檢測物之前的光強(qiáng)度;Ι 為從被檢測物出來的光強(qiáng)度。OD 值由下述公式計(jì)算:E=OD=C×D×E 其中:C 為檢測物的濃度;D 為檢測物的厚度;E 為摩爾因子。
酶標(biāo)儀:即酶聯(lián)免疫檢測儀(ELISA Reader)是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的儀器。可簡單地分為半自動(dòng)和全自動(dòng)兩大類,但其工作原理基本上都是一致的,其核心都是一個(gè)比色計(jì),即用比色法來分析抗原或抗體的含量。ELISA 測定一般要求測試液的終體積在250ul 以下,用一般光電比色計(jì)無法完成測試。因此對酶標(biāo)儀中的光電比色計(jì)有特殊要求。
ELISA 實(shí)驗(yàn)原理:用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或者標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗體,HRP 標(biāo)記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物顯色。底物在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的目標(biāo)蛋白呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在(450nm)波長下測定測定吸光度,計(jì)算樣品濃度。
1.1 酶標(biāo)儀測糧食中的黃曲霉毒素含量儀器、試劑①美國熱電 MK3 型酶標(biāo)儀;賽多利斯電子天平(感量 0.1 克);50 微升移液器及配套吸頭;恒溫培養(yǎng)箱(0℃-50℃);冰箱(4℃-8℃);玻璃器皿:錐形瓶,燒杯,分液漏斗,蒸發(fā)皿,量筒,具塞試管,滴管,移液管;濾紙等。②黃曲霉毒素 Bl 酶聯(lián)免疫定量測試盒;石油醚;甲醇;蒸餾水。
1.2實(shí)驗(yàn)步驟
1.2.1樣品處理方法:稱5.0g樣品(已粉碎)于100ml具塞三角瓶中。準(zhǔn)確加入 25.0ml 甲醇水(1+1)溶液,加塞振搖 15min,棄去 1/4初濾液,收集試樣濾液,此液為樣品提取液。假設(shè)樣品不需稀釋,此液則為待測樣液。
1.2.2試劑的配制①每瓶C試劑(酶標(biāo)抗原)中準(zhǔn)確加入1.5mlD試劑(酶標(biāo)抗原稀釋液),充分溶解,配成實(shí)驗(yàn)用酶標(biāo)抗原溶液,2℃——8℃保存。②取適量 E 試劑(濃縮洗滌液)用蒸餾水稀釋 20 倍待用。
1.2.3操作流程:樣品提取,適當(dāng)稀釋,試劑準(zhǔn)備,加樣,在溫度37℃下進(jìn)行免疫反應(yīng)30min,然后在37℃下進(jìn)行顯色反應(yīng)15min,結(jié)果判定,計(jì)算含量。
2 結(jié)果計(jì)算
建立公式:X(ng/g)=C×VM×D式中:X:黃曲霉毒素B1含量(ng/g);C:待測樣液中黃曲霉毒素Bl含量(ng/m1);V:樣品提取液體積(m1);M:樣品質(zhì)量(g);D:樣品稀釋倍數(shù)。
3 酶標(biāo)儀的使用注意事項(xiàng)
3.1 工作環(huán)境 酶標(biāo)儀是一種精密的光學(xué)儀器,因此良好的工作環(huán)境不僅能確保其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,還能夠延長其使用壽命。
①儀器應(yīng)放置在無磁場和干擾電壓的位置。
②儀器應(yīng)放置在低于 40 分貝的環(huán)境下。
③為延緩光學(xué)部件的老化,應(yīng)避免陽光直射。
④操作時(shí)環(huán)境溫度應(yīng)在 15℃——40℃之間,環(huán)境濕度在 15%——85%之間。
⑤操作電壓應(yīng)保持穩(wěn)定。
⑥操作環(huán)境空氣清潔,避免水汽,煙塵。保持干燥、干凈、水平的工作臺(tái)面,以及足夠的操作空間。
3.2 操作注意事項(xiàng) 酶標(biāo)儀的功能是用來讀取酶聯(lián)免疫試劑盒的反應(yīng)結(jié)果,因此要得到準(zhǔn)確結(jié)果,試劑盒的使用必須規(guī)范。在酶標(biāo)儀的操作中應(yīng)注意以下事項(xiàng):①使用移液器加液,移液頭不能混用。②洗板要洗干凈。如果條件允許,使用洗板機(jī)洗板,避免交叉污染。③嚴(yán)格按照試劑盒的說明書操作,反應(yīng)時(shí)間準(zhǔn)確。④請勿將樣品或試劑灑到儀器表面或內(nèi)部,操作完成后請洗手。⑤如果使用的樣品或試劑具有污染性、毒性和生物學(xué)害,請嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明,以防對操作人員造成損害。⑥不要在測量過程中關(guān)閉電源。⑦對于因試劑盒問題造成的測量結(jié)果的偏差,應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況及時(shí)修改參數(shù),以達(dá)到佳效果。⑧使用后蓋好防塵罩。
3.3 閾值可疑范圍的設(shè)定 一般酶標(biāo)儀閾值矩陣設(shè)定可設(shè)定陰性、可疑、陽性 3 個(gè)范圍。有經(jīng)驗(yàn)表明可疑范圍的設(shè)定要設(shè)定為臨界上下15%(也稱灰色區(qū))為宜;同時(shí)陰性范圍下限和陽性范圍應(yīng)該充分考慮到影響 ELISA 結(jié)果因素的存在,可疑范圍上限必須考慮到雙波長情況下出現(xiàn)負(fù)吸光度值和超范圍報(bào)告影響結(jié)果的可能性。“灰色區(qū)”的結(jié)果的真實(shí)性是 ELISA 定性測定中需要把握的環(huán)節(jié),也是實(shí)驗(yàn)室引起醫(yī)療糾紛的主要方面,因此必須對可疑結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢,用兩種試劑盒。
3.4 樣本名字文件設(shè)定 由于部分試驗(yàn)的所測樣本不一定是連續(xù),樣本命名顯得尤為重要。同時(shí)應(yīng)做到樣本名字文件與吸光度值文件保持一致,這樣若以后再調(diào)出吸光度文件時(shí),樣本名字文件可自動(dòng)同時(shí)調(diào)出;若大批量樣本時(shí)應(yīng)對不同微孔板編號區(qū)別(以文件后綴形式)。
3.5 樣板程序文件設(shè)定 一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同一試驗(yàn)可能使用不同廠家試劑盒,但不同試劑盒規(guī)定的設(shè)定對照數(shù)量、閾值判定標(biāo)準(zhǔn)等均可能不一致,酶標(biāo)儀所設(shè)樣板程序也不一致。為了使用方便,可在樣板程序文件中用后綴加以區(qū)別。
3.6記錄管理 隨著我國法律的不斷完善,人們的法制觀念不斷增強(qiáng),建立健全原始記錄十分重要和必要。原始記錄不僅是儀器打印出來的數(shù)據(jù),還應(yīng)記錄試劑盒廠家、批號、效期、質(zhì)控物來源、批號、效期、檢測者、復(fù)核者等相關(guān)內(nèi)容,同時(shí)可用原始記錄進(jìn)行資料分析,更好地開展工作。但要注意的是原始記錄不宜保存在電腦內(nèi),應(yīng)打印后裝訂保存。

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